微生物学

Fig. 4.1 Image

微生物学是研究微观生物体的学科，其研究对象包括细菌、真菌（霉菌和酵母菌）、藻类、原生动物和病毒。

微生物学历史上的重大事件

• 自学成才的荷兰人安东尼·范·列文虎克（1632-1723），制造了可观察到细菌的显微镜，被称为“显微镜之父”。
• 法国化学家路易·巴斯德（1822-1895），发明了一种热处理方法，这种方法如今被称为巴氏杀菌法。
• 德国医生、1905年诺贝尔医学奖得主罗伯特·科赫（1843-1910），相继发现了结核杆菌和霍乱弧菌等多种致病菌。另外，他还设计了诸多巧妙而简易的方法，以便安全地研究这些微生物。
• 英国微生物学家、教授及1945年诺贝尔医学奖得主亚历山大·弗莱明（1881-1955），于1929年发现了对多种细菌（除结核杆菌外）具有抑制作用的青霉素。
• 美国真菌学家、微生物学家及1952年诺贝尔医学奖得主塞尔曼·A·瓦克斯曼（1888-1973），发现了对结核杆菌在内的多种细菌均有抑制效果的链霉素。

自然界中的微生物

微生物无处不在——在大气中、水中、动植物体上以及土壤中，它们能够分解有机物，在自然界的物质循环中扮演着重要角色。

有食物、有水分且温度适宜生长的环境，微生物最为丰富。由于多种微生物生存和生长的适宜条件，与人类正常生活环境高度重合，我们注定要与众多微生物共同生存。

下表列出了不同微生物类群的主要特征：

原生动物

• 单细胞小型水生生物
• 可摄取固体食物颗粒
• 最终成为鱼类及大型动物的食物
• 通常不会导致食品腐败
• 少数原生动物为食源性病原体（通过水传播）
• 部分原生动物为病原体（通过昆虫传播）

藻类

• 单细胞或多细胞水生生物
• 含叶绿素，可进行光合作用
• 用作食品补充剂和药品
• 有些是微生物培养基的琼脂来源
• 有些会产生有毒物质
• 通常不会导致食品腐败

酵母菌

• 呈卵圆形或圆形的单细胞生物
• 常见于土壤、植物及果实等多种环境
• 用作食品补充剂及酿酒原料
• 食品（尤其是高酸食品）腐败微生物

霉菌

• 具有多种独特特征的多细胞生物
• 常见于土壤，亦存在于水体与空气中
• 承担多种物质的分解作用
• 可用于青霉素等化学物质的工业化生产
• 可能引发人畜及植物病害
• 食品（尤其是高酸食品）腐败微生物

细菌

• 具有高度多样性的微生物类群
• 几乎存在于所有环境
• 部分为致病菌，部分在自然界的元素循环中起重要作用（从而有助于提升土壤肥力）
• 可用于高价值化合物的工业生产
• 部分菌种导致食品腐败，部分则用于食品加工

病毒

• 只能在活细胞中繁殖，均为寄生物

生物工艺学

“生物工艺学”是一个新兴概念，意为利用生物工艺的技术。生物工艺学的历史比微生物学、生物化学及加工技术等现代学科早数千年。

直至十九世纪末，这些工艺主要应用于食品领域，尤其是食品保存方面。

微生物工艺仍在食品工业中占重要地位，但现代生物工艺学主要指：利用活细胞或细胞成分的特性进行工业化生产，以获得酶、激素和特定疫苗等产品。为此，必须综合运用生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学和免疫学等生物科学知识，以及设备设计、工艺工程、分离技术和分析方法等相关技术。

本章主要探讨与牛奶及乳制品加工相关的微生物，同时也会介绍一种称为“噬菌体”的特定病毒。在需要微生物参与风味、质地等特性形成的产品生产过程中，噬菌体会引发严重问题。

细菌

细菌是单细胞生物，通常通过二元裂变增殖，即一个分裂为两个。部分细菌的分类依据是其外观。但为了能够看清细菌，必须在放大约1000倍的显微镜下对其进行研究。

此外，还可对细菌进行染色。最广泛使用的细菌染色法由丹麦细菌学家革兰氏提出，称为革兰氏染色法。根据革兰氏染色特性，细菌可分为两大类：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈蓝色。这种显色差异源于细菌包膜的差异，使两类细菌具有不同的特性。

细菌形态学

细菌形态学是研究细菌形态的学科。研究范围包括形状、尺寸、细胞结构、运动性（在液体中移动的能力）以及芽孢和荚膜的形成等形态特征。

细菌的形状

细菌具有多种不同形状。但可区分出三种主要的特征形状：球状、杆状和螺旋状。

球状细菌称为球菌；成对排列的球菌称为双球菌（图4.2）；成链排列的球菌称为链球菌（b）。球菌也可呈葡萄串状不规则排列（c），或四个一组或排列形成立方体（d）。

图4.2 球形细菌（球菌）以不同排列形态存在

图4.3 杆状和螺旋状细菌

杆状细菌的长度和厚度均存在差异。部分杆状细菌还会像许多芽孢杆菌一样形成链状结构（图4.3）。

螺旋状细菌的长度和厚度可能存在差异，其旋转周数也各不相同。旋转周数较多的螺旋状细菌属于体型最大的细菌类别之一，常见个体的长度可达20 μm。

细菌的细胞结构与功能

从功能和结构上来说，生命的最小基本单位是细胞，而细菌具有最简单的细胞组织。细菌细胞属于原核细胞。所有其他细胞（包括真菌、藻类、原生动物、植物和动物细胞）均为真核细胞。细菌细胞所需的最小结构组成单元数量相对较少。细胞壁是唯一的刚性结构成分。它赋予细胞特定形状。细胞壁厚的细菌是革兰氏阳性菌，细胞壁薄的细菌是革兰氏阴性菌。细胞膜决定了细胞内外的物质。只有水溶性物质能通过细胞膜转移。因此，如果没有水，细胞就无法与其环境进行物质交换，也无法生长。革兰氏阴性菌在细胞壁外侧还有一层由脂多糖构成的第二层膜。细菌死亡后，仍可检测到该膜结构，该膜结构可提示酶活性（有时其活性过低而难以检测到）。

细菌细胞内部的物质可分为两个易识别部分：细胞质与染色体。染色体的DNA（脱氧核糖核酸）中携带了遗传信息。原则上，一个细菌仅含有一条染色体，即一个DNA分子。其信息会在细胞质中转化为酶。在电子显微镜图像中，细胞质通常呈颗粒状。细胞成分的实际合成场所是核糖体，由蛋白质和RNA（核糖核酸）构成。除可识别的结构成分（如图4.4）外，细胞质中还存在多种溶质：分解产物、维生素、辅助因子以及用于合成细胞成分的构建单元。

图4.4 细菌细胞示意图

细菌的运动性

有些球菌和许多杆菌能在液体营养介质中移动，它们借助鞭毛推进自身——这些长而坚硬的丝状附属物从细胞质膜中长出（图4.5）。鞭毛的长度和数量因细菌种类而异。

图4.5 鞭毛可遍布菌体周身，或集中于一端或两端

细菌运动速度一般为每秒达自身长度的1-10倍。霍乱弧菌可能是速度最快的菌种之一，其每秒钟可移动自身长度的30倍。

芽胞形成

只有几个属种的细菌能形成芽胞：芽孢杆菌和梭状芽胞杆菌最广为人知。芽孢是细菌抵御不良条件（如高温、消毒剂、干燥环境或营养缺乏）的保护形式。图4.6展示了芽孢形成的若干不同类型。

图4.6 细菌中芽胞形成的不同类型

当母细胞形成芽胞时，其可能保持原始形态，也可能在中间或一端膨胀，具体取决于芽胞所在位置。芽胞形成过程中，细胞的营养体部分会死亡，最终细胞溶解并释放出芽孢。

当环境条件再次变得适宜时，芽孢又萌发形成营养细胞并开始繁殖。

芽孢是处于休眠状态的细胞，无代谢活动，因此无法增殖。它们在干燥的空气中能生存数年，而且比细菌更能抵抗化学灭菌剂、抗生素、干燥和紫外线照射。芽孢还具有耐热性：通常需在120℃热水或蒸汽中处理20-30分钟才能将其灭活。

荚膜形成

部分杆菌和球菌被发育成熟的黏液状荚膜包裹。这种结构使其对干燥环境具有较强抗性。此类细菌在牛奶中生长会使牛奶质变得黏稠滑腻，导致粘质牛奶的形成。

细菌生长的条件

营养物质

细菌生长需要一定的营养物质。不同种类的细菌对营养物质的要求差异很大。细菌的主要食物来源是有机化合物，例如，蛋白质、脂肪和碳水化合物。此外，少量微量元素和维生素也是生长所必需的。

有机物除作为构成细胞的原材料外，还蕴含必需能量。此类物质必须可溶于水且具有低分子量（即能分解为极小分子），以便能穿过细胞质膜被细菌代谢利用。因此，细菌需要获得水。

部分微生物缺乏释放胞外酶分解物质的能力，必须利用其他微生物产生的分解产物。这种关系称为共生，双方均从中获益。当一种生物产生对其他生物具有抑制作用的物质时，该过程称为抗生。

水分活度

微生物的生长和代谢需要可利用的水。衡量水分可利用性的最有效指标是水分活度a_w。通过去除水分或添加溶质的方式，提高食品水相中的溶质浓度，可降低食品的a_w值。部分水分子会围绕溶质分子定向排列，另一部分则被不溶性食物组分吸附。在这两种情况下，可用于化学反应的水都会减少。

脱水是一种通过去除水分降低a_w值的食品保存方法。在盐渍和糖渍工艺中，添加溶质可降低a_w值从而保存食物。当与其他因素结合时，即便只是小幅降低a_w，往往也足以实现食品的保存。

公式 4.1

水分活度的定义

食品或溶液的水分活度（a_w）等于相同温度下食品水蒸气压（p）与纯水蒸气压（p₀）的比值。当溶液浓度升高时，水蒸气压下降，a_w值从纯水状态下的最大值开始降低。

水分活度对生长的影响

多数微生物（包括致病菌）在a_w值为0.99-0.98的范围内生长最快。低于此a_w值时，微生物生长速率下降，迟缓期延长（图4.7）

图4.7 aw对生长的影响

大多数与食品相关的微生物在a_w≥0.98时达到最佳生长速率，该范围也是牛奶及常见饮料的典型a_w值区间。部分革兰氏阴性菌凭借生长速率优势而拥有最强竞争力，即如果存在，它们将主导微生物菌群。例如在牛奶中，革兰氏阴性菌感染常会掩盖革兰氏阳性菌感染。

当a_w值降至0.93-0.98区间时，革兰氏阳性菌（如乳酸杆菌、芽孢杆菌和微球菌）占据主导地位，但仍可能存在少数耐受性大肠杆菌。此时，食源性致病菌（沙门氏菌、肉毒杆菌、产气荚膜梭菌）无法增殖。相比之下，在a_w=0.94时，金黄色葡萄球菌仍能以其最大生长速率的50%生长。在该范围内，真菌有可能导致低酸食品变质，并能与引发食品变质的细菌形成竞争关系。

当a_w值介于0.93至0.85之间时，可能的腐败微生物包括球菌、霉菌和酵母菌。此范围内唯一能生长的致病菌是金黄色葡萄球菌。为抑制金黄色葡萄球菌，中等水分食品的a_w值设计为<0.85。

当a_w值介于0.85至0.60之间时，少数霉菌和酵母菌可能引起腐败。a_w值在该范围内的常见食品有经高糖腌制的果酱和果冻。此aw值范围内不可能产生霉菌毒素。当a_w<0.60时，所有微生物均无法生长。a_w值在该范围内的食品可避免进一步因微生物作用而变质。但仍需强调，受前期加工贮存过程影响，此类食品仍可能含有存活微生物（包括致病菌）和/或毒素。

温度

图4.8 细菌生长的温度条件

温度是影响微生物生长、增殖及食品腐败的最重要单一因素（图4.8）。细菌只能在特定温度范围内发育，该范围因菌种而异。原则上，细菌的生长温度范围介于水的冰点与细胞质内蛋白质的凝固温度之间。在最高与最低温度（即上下限）之间存在最适温度区间，细菌菌株在此区间内增殖最为旺盛。

低于最低温度会抑制细菌生长，但不会导致其死亡。在接近水的冰点温度时，细菌的生命活动几乎完全停止。由于细胞的含水量很高，在此温度下细胞会冻结。此时细菌无法再通过细胞膜吸收营养。

当温度超过最高温度时，细菌会因过热迅速死亡。多数细胞在70℃环境下暴露数秒即死亡，但一些细菌即使无芽孢形成，仍能在80℃环境下存活5分钟。

杀死细菌芽孢需要更强的热处理强度，且干热灭菌效果不如湿热灭菌。120℃蒸汽处理30分钟可确保所有芽孢失活，但干热灭菌需在160℃下持续两小时才能保证芽孢失活。 

按温度分类

图4.9 根据适宜生长温度将细菌分类

根据最适温度范围，细菌可分为以下类别（图4.9）：嗜冷（喜冷）菌在0℃下能良好生长，最适温度约为12-15℃，最高温度低于20℃。

耐冷（耐寒）菌是能在商业制冷温度下增殖的嗜温菌株，最适温度约为20-30℃。

嗜温菌的最低温度约为10℃，通常最适温度为30-35℃，最高温度约为50℃。毫无疑问，这是细菌生长最常见的温度区间。约90%的细菌均能在此温度区间生长。

嗜热（喜热）菌的最适生长温度为55-65℃，最低温度约为37℃，最高温度约为70℃。耐冷菌对乳业尤为重要，因为原奶和市售乳中的微生物活动通常在7℃或更低的温度下进行。

氧

许多微生物需要游离氧来氧化食物以产生能量，维持生命活动。有机化合物完全氧化后形成二氧化碳和水。许多微生物能从空气中获得氧气，这些微生物被称为需氧微生物。而其它微生物无需游离氧即可从食物中获取能量，这些微生物被称为厌氧微生物。

有些细菌在有游离氧的情况下会消耗游离氧，但在没有游离氧的情况下也能生长，这种细菌被称为兼性厌氧菌。厌氧菌和兼性厌氧菌一般通过发酵有机化合物来获得能量。从化学角度看，这是一种不完全氧化，会产生有机废物，比如乳糖产生的乳酸（见表4.2）。由于绝大多数微生物从空气获得氧气，即它们是需氧微生物，因此去除氧气/空气是控制或抑制其生长的一种手段。

相关实例包括真空包装、气体包装以及使用阻隔空气的材料。厌氧菌暴露在有氧条件下一段时间便会死亡。

光照

光照仅对能捕获光能的光合细胞至关重要。微生物（包括大多数细菌）暴露于直射阳光下易被灭活。阳光中的紫外线会导致DNA和细胞蛋白质发生化学变化。

紫外线常被用于发酵剂培养室内空气环境的消毒，但不可用于食品消毒，因其也可能引发食品成分的化学变化。

pH值——酸度对微生物生长的影响

大多数自然环境的pH值介于5至9之间，最常见微生物的最适生长范围与此一致。多数霉菌和酵母菌在弱酸性介质（pH值5-6）中生长最佳，而细 菌的最适环境为中性或弱碱性。

鲜乳的pH值通常为6.6-6.8。霉菌和酵母菌通常在pH值低至3（甚至低至2）的环境下仍能生长良好。大多数非加工食品的pH略低于中性（即属于低酸食品）。果汁通常属于高酸食品（图4.10）。

图4.10 酸度对微生物生长的影响

细菌的增殖

细菌通常通过二元裂变方式增殖。图4.11展示了这一增殖过程。每个细胞生长达到临界尺寸后，会分裂为两个完全相同的细胞。对于特定菌种而言，其细胞排列方式通常保持稳定，会形成特征性细胞群集。细胞群集可呈现链状、成对或簇状形态，这一特征因此也成为不同菌种的分类依据之一。

图4.11 细菌的增殖

增殖速度

在适宜条件下，细菌的增殖周期为20-30分钟。细菌增殖的速度可用下面的公式表示。假如世代时间为0.5小时，每毫升乳中有一个细菌，则10小时内每毫升乳中细菌将增殖至一百万个。在最佳条件下，细菌数量可达1亿-10亿/毫升。此时，由于缺乏营养，以及有毒代谢废物的积累，其生长速度将受到抑制。最后繁殖停止，大量细菌死亡。实际上，不适宜的条件，比如低温贮藏或低pH值将限制或延缓食品中细菌的生长。

公式 4.2

细菌生长曲线

图4.12展示了接种到培养基上的细菌的生长曲线。在细菌开始繁殖之前通常要经过一段延迟期，因为其必须先适应新的环境，这一生长阶段（a）称为迟缓期。迟缓期的出现也可能是因为培养物需要恢复活性（例如接种前经低温保存）。

迟缓期长度取决于接种时细菌受抑制的程度。迟缓期结束后，细菌开始以对数方式增殖。此阶段（b）称为对数期或指数期。

一段时间后，毒性代谢废物在培养物中积累。随之而来的是细菌的增殖速度减慢，同时，细菌不断死亡，旧细胞的死亡和新细胞的形成达到平衡状态，这一阶段（c）称为稳定期。

在下一个阶段（d），新细胞的形成完全停止，旧细胞相继死亡，最终培养物几乎灭绝，这一阶段称为衰亡期。

曲线形态（即各阶段时长与曲线斜率）受温度、营养供应、其他生长参数及菌种的共同影响。

图4.12 细菌生长曲线

生化活性

微生物的生化活性可导致食品腐败及动植物病害。部分微生物的生化活性被应用于食品加工（如干酪、酸奶、黄油等制品的生产）。特定微生物的活性由其自身所含的酶决定，这些酶决定了微生物的营养来源、分解能力以及代谢终产物。

微生物中有许多生化和酶系统，以下系统是与牛奶及乳制品相关的主要系统，可根据其分解的组分及其产生的影响进行细分。

碳水化合物的分解

碳水化合物（即糖类）的分子式为(CH₂O)_n，最初被认为是碳的水合物。有单糖、双糖和多糖之分。多糖是由一种或多种糖构成的长链化合物（例如纤维素、淀粉和几丁质）。微生物的酶决定了其可分解的碳水化合物类型及分解程度。在牛奶中，双糖乳糖经水解会分解为葡萄糖和半乳糖。

它们可完全降解为二氧化碳和水（氧化代谢），但在大多数情况下会发生发酵。发酵通常会产生各种产物，如有机酸（乳酸、丁酸等）、醇类（乙醇、丁醇等）和气体（二氧化碳、氢气等）（表4.3）。

微生物活动引发的最重要发酵形式包括：

• 酒精发酵：将碳水化合物分解为酒精和气体。例如乳糖分解为乙醇和二氧化碳。该过程通常在厌氧条件下进行，主要由酵母菌引发。
• 乳酸同型发酵：分解乳糖，唯一终产物为乳酸。这种反应常用于干酪、酸奶和其它酸性产品的生产。
• 乳酸异型发酵：分解乳糖，产生乳酸、乙酸、二氧化碳和乙醇
• 大肠杆菌发酵（混合酸与丁二醇）：分解乳糖，产生多种终产物，包括乳酸、乙酸、琥珀酸、甲酸、丁二醇、乙醇、二氧化碳和氢气。
• 丁酸发酵：由某些种类的梭状芽孢杆菌在严格厌氧条件下进行。在该过程中，乳糖被分解为丁酸、二氧化碳、氢气，有时还会产生丁醇。

一般而言，牛奶中的碳水化合物发酵会导致产酸（酸败），某些情况下还会产气（具体取决于微生物种类）。

蛋白质的分解

蛋白质被分解的过程叫蛋白质水解。蛋白酶（如凝乳酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶）是参与这一过程的主要酶类。这些酶将蛋白质降解成各种多肽，然后再经过不同的肽酶降解成更小的多肽和游离氨基酸。氨基酸可被细胞利用，再次合成蛋白质，但它们也可以被氧化或发酵分解。

蛋白质及其组成氨基酸具有多样的化学元素组合，包含碳、氢、氧、硫、氮和磷。因此蛋白质的分解会产生更广泛的酸类、醇类、气体（氢气、二氧化碳、硫化氢和氨）及其他化合物。蛋白质分解几乎都能形成碱性的、强刺激性气味的氨。见图4.13。

胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸这三种氨基酸含有硫，会产生具有臭鸡蛋般强烈气味的硫化氢。

液态奶中蛋白质分解的两个主要阶段（称为胨化）包括：

• 通过类凝乳酶使乳发生凝固（甜味而非酸味）或凝结。该乳质缺陷称为甜凝乳，常见于温热储存的巴氏杀菌奶。
• 蛋白水解，产生具碱性的氨。

随着蛋白水解过程的推进，干酪中游离氨基酸和氨的含量可指示其陈化程度与成熟度。蓝纹干酪或霉菌成熟干酪蛋白水解速度快，会产生大量氨。

图4.13 蛋白质在蛋白酶和肽酶的作用下分解为氨基酸

脂肪的分解

脂肪被酶分解的过程称为脂解。脂肪酶是参与 该过程的主要酶。在脂解过程中，脂肪被水解为甘油及一种、两种或三种独立脂肪酸（图4.14）。部分脂肪酸具有挥发性，会释放强烈气味。例如丁酸会产生典型的酸败味。

纯脂肪无法被微生物分解，但水乳液中的脂肪或与水接触的脂肪可被多种微生物分解。水分对酶促分解至关重要。黄油和奶油形式的乳脂属于含水乳液，且含有蛋白质、碳水化合物、矿物质等成分，这有时使其更易发生酶促分解。

许多能够分解蛋白质的细菌和霉菌同时也能氧化分解脂肪。

图4.14 脂质在脂肪酶的作用下分解为游离脂肪酸和甘油

卵磷脂的分解

卵磷脂（脂肪球膜所含的磷脂）是甘油、两个脂肪酸、磷酸和胆碱（一种有机碱）的化合物。蜡样芽孢杆菌菌株产生的酶——卵磷脂酶，可将卵磷脂水解为甘油二酯和磷酸胆碱。脂肪球膜由此破裂，产生不稳定的脂肪乳液，常表现为漂浮在牛奶或奶油表面的絮状或块状物质。该牛奶或奶油缺陷称为“奶油结团”或“奶油分层”。

胆碱进一步分解为三甲胺时，会产生鱼腥味。

色素和颜色的产生

产生颜色的过程称为色素形成，导致颜色产生的微生物称为产色菌。

这种代谢过程是部分微生物的典型特征。其在某些食品中的显色程度高于其他食品，且仅在环境温度或更低温度下发生。需氧条件也有利于色素形成。

色素分为两种：

• 内生色素：存在于细胞内
• 外生色素：扩散到细胞外周食品中

有三种基础色：

1. 类胡萝卜素：黄色、绿色、奶油色或金色
2. 花青素：红色
3. 黑色素：褐色或黑色

生物种类常根据其产生的颜色来命名，例如：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）=金黄色的葡萄球菌。

黏液生成

某些细菌会产生多糖类黏液，因高度水溶性且能在培养基中溶解，会显著增加黏度。该特性应用于某些发酵产品（如酸奶和瑞典粘稠乳långfil）。

气味生成

某些微生物会产生强烈气味。以下列举部分微生物及其关联气味：

• 霉菌——霉味
• 放线菌——土腥味
• 酵母菌——酵母味
• 假单胞菌科——果香/鱼腥味
• 大肠杆菌——粪臭味
• 乳酸乳球菌变种——麦芽味

原奶中的致病菌

部分微生物可通过中毒和/或感染途径引发食物中毒（致病微生物，表4.4）。中毒指食品被食用前已产生毒素。感染指此类微生物在人体内定植、活跃生长和增殖。通常需要相当大的数量才能引发感染，但有时（如大肠杆菌O157:H7，即EHEC）最小感染剂量（MID）可低至1个细菌。

细菌研究

细菌在自然界中的数量极其庞大，由许多不同的菌种组成。为研究特定菌种的特性，需将其与其他菌种分离。目前已有为此而设立的实验室程序。

在实验室容器（如试管）中培养同一菌种的细胞群称为纯培养。为保持培养物纯度，需持续采取预防措施防止其他菌种入侵，此过程通过无菌技术实现。

细菌在营养肉汤或营养琼脂中培养。营养物类型因菌种而异，典型营养物包括蛋白质、多肽、糖类、矿物盐和辅助因子的混合物。为制备营养琼脂，需向肉汤中添加一种名为琼脂的果冻状半硬性物质。

在琼脂基质表面或内部培养的微生物会形成菌落。在适宜条件下，单个细胞将增殖为肉眼可见的细胞团（称为菌落形成单位，CFU）。通过稀释原始样品、平板涂布并计算菌落数量，可实现对细菌的计数。这种成熟的细菌、酵母菌和霉菌计数技术称为菌落计数法。

使用选择性琼脂培养基（仅允许特定细菌类群生长）可验证多种细菌是否存在。

细菌的鉴定和分类

对许多不同细菌的分类，过去都是按高等动植物分类方法将其分成科、属、种。

在动物学和植物学中，均根据生物的外部特征（外观）进行分类。在细菌分类中，原先也采用同样的原则，但不久就发现不能简单地从细菌的大小、形状、外观和运动性来分类。除这些外观特征外，还需要考虑有机物的代谢（与各种碳水化合物、蛋白质、脂肪等的关系）及其菌株特征。根据上述这些特征，可在细菌分类系统中对相似微生物进行归类。

基于该系统的细菌拉丁学名现今已在国际上通用。每种细菌均拥有两个名称：第一个代表属，第二个描述种（通常指示特定属性或来源）。参见前文章节《色素和颜色的产生》。

对细菌属的鉴定需结合生化测试与形态学分析（包括革兰氏反应）进行。

目前基于DNA组成的新技术已被引入细菌鉴定领域，其中最重要的是PCR反应（聚合酶链式反应）。该方法可直接鉴定细菌的种类，现今已成为致病菌鉴定的常规手段。FTIR（傅里叶变换红外光谱）法可在分子水平比对多种细菌成分与模式菌种数据库。在细菌鉴定领域，最权威的文献是《伯杰 氏鉴定细菌学手册》。其第9版（1994年）收录了数千个菌种，但这仅占自然界现存菌种的一小部分。仍有大量研究工作待完成，未来版本的《伯杰氏手册》必将涵盖更广泛的菌种。

奶牛乳汁中的细菌

乳汁在乳房内分泌时几乎是无菌的。然而，即使是在离开乳房前，乳汁也会受到从乳头管进入的细菌的感染，如图4.15所示。这些细菌通常无害且数量稀少（每毫升最多数百个）。然而，如果奶牛罹患细菌性乳房炎（乳腺炎），乳汁会被细菌严重污染（见图4.16），甚至不宜食用。该病症还会导致奶牛痛苦。

乳头管内始终存在细菌聚集，但大部分会在挤奶初期被冲出。建议将每个乳头最初含菌量较高的乳汁收集在带黑色盖子的独立容器中，如图4.17所示。患病乳畜的絮凝乳在黑色背景下清晰可辨。

图4.15 细菌从乳头管进入

图4.16 乳房炎期间乳汁遭受严重细菌污染

图4.17 将每个乳头最初含菌量较高的乳汁收集至带黑色盖子的独立容器中

牧场污染

在牧场处理过程中，乳汁易受多种微生物（主要是细菌）污染。污染程度与菌群组成取决于奶牛环境的清洁度，以及乳汁接触表面的卫生状况（如挤奶桶或挤奶机、过滤器、运输桶或储罐以及搅拌器）。被乳汁润湿的表面通常比乳房本身具有更大的污染风险。

手工挤奶时，细菌可通过挤奶工、奶牛、垫草和周围空气进入乳。污染程度取决于挤奶员的技术水平和卫生意识以及对奶牛的管理方法。机器挤奶可排除大部分污染源，但同时也带来另一问题，如果挤奶设备未经适当清洗，牛奶中将会进入大量的细菌。

奶牛乳头与乳房的清洁度会显著影响乳汁中芽孢的含量。

原奶中的细菌

牛奶营养丰富，但很容易滋生各种细菌并受到污染。

农场牛奶的含菌量差异显著：若来自卫生良好的牧场，每毫升仅含数千细菌；若清洁、消毒和冷却标准低下，则可能高达数百万。因此，所有牛奶设备的日常清洁与消毒是决定牛奶细菌学质量的最关键因素。在最佳条件下，每毫升牛奶中的细菌总数应低于20000 CFU（菌落形成单位）。快速冷却至4℃以下对保障农场牛奶品质至关重要。该处理可延缓牛奶中细菌生长，从而显著提升其保存质量。

图4.18 温度对原奶中细菌繁殖的影响

温度对原奶中细菌繁殖的影响如图4.18所示。以300000 CFU/毫升为起始点，高温下细菌的繁殖速度与冷却至4℃后细菌生长的抑制效果对比显著。若在挤奶后立即将牛奶冷却至4℃（甚至更低至2℃），并做好挤奶容器/奶罐的隔热保温，即可实现每两日配送一次的牛奶供应模式。

污染主要来自三个源头：奶牛体内、乳头与乳房，以及与乳汁接触的所有表面。优质原奶（<20000 CFU/毫升）中最常见的微生物仅限于少数几类细菌（表4.5）。

巴氏杀菌奶中的细菌

牛奶的HTST（高温短时）巴氏杀菌可杀灭热敏感微生物。存活菌包括芽孢菌、棒状杆菌及其他少数革兰氏阳性杆菌与球菌。这类相对耐热的菌群称为耐热菌群。优质牛奶中的耐热菌数量通常为200-300 CFU/毫升。

HTST牛奶中革兰氏阴性菌的出现主要源于水源性再污染（如渗漏或其他卫生不达标情况）。由于许多革兰氏阴性菌在冷藏温度下仍生长良好，它们会导致HTST牛奶在数日内变质。因此，必须对革兰氏阴性菌进行常规实验室检测。

真菌

真菌是一类常见于自然界（植物、动物及人体）的微生物。不同种类的真菌在结构和繁殖方式上存在显著差异。真菌可呈圆形、卵圆形或丝状。菌丝可形成肉眼可见的网络状结构，例如食品表面的霉菌。真菌可分为酵母菌和霉菌。

酵母菌

酵母菌是球形、椭圆形或圆柱形的单细胞生物。不同酵母细胞尺寸差异显著：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）直径为2-8μm，长度为3-15μm。其他菌种的一些酵母细胞可达100μm。

与霉菌类似，酵母菌的内部结构比细菌更复杂——其细胞质内含清晰可辨细胞核，由核膜包裹（图4.19）。细胞由细胞壁和细胞膜包裹，该膜能使养分进入，废物排出。

图4.19 酵母细胞结构示意图

该细胞有一个液泡，用于贮存养料和在废物排出细胞前暂存废物。细胞质中含有脂肪球和碳水化合物颗粒。细胞质内还存在名为内质网的膜状细网、线粒体（细胞生长所需能量的生成场所）以及核糖体。

酵母菌的繁殖

酵母细胞通常通过出芽方式繁殖，如图4.20所示，但也存在其他繁殖方式。出芽是无性繁殖过程：母细胞壁上会形成小芽体，亲代和子代暂时共享细胞质，最终芽体通过双层壁结构与母细胞隔离。

图4.20 出芽酵母细胞

子细胞并非总是与母体分离，可能保持附着状态，同时，母体继续形成新芽体。子细胞自身也可产生新芽体，从而形成相互附着的大型细胞簇。

部分酵母菌通过形成孢子、囊孢子和担孢子（不可与细菌芽孢混淆）进行有性繁殖，如图4.21所示：两个细胞融合，细胞核同步融合。核物质分裂后，细胞内形成8个囊孢子，各含相似DNA组。孢子成熟后释放并萌发形成新细胞，然后通过出芽进行无性繁殖。

图4.21 酵母菌的有性繁殖

酵母菌的生长条件

环境与营养

酵母菌和其他生物一样需要营养。它们通常在含糖环境中（例如果实、花朵及树皮）大量繁殖。少数菌种对动物和人类具有致病性。酵母菌是果汁中最主要的腐败微生物。与细菌类似，酵母具备胞内和胞外酶系统，能够将基质中的大分子分解为适于细胞代谢的尺寸。实验室中，酵母常在pH值为5至6的富糖基质中培养。

水分

与细菌类似，酵母菌生存必须接触水分，但其需水量低于细菌。部分菌种可在极低水分含量的介质 （如蜂蜜或果酱）中生长。

酸度

酵母菌可在pH值3至7.5的介质中生长，最适pH值通常为5-6。

温度

在低于水的冰点或者高于47℃的温度下, 酵母细胞一般不能生长，最适生长的温度一般为20-30℃。许多属包含耐冷菌株，例如假丝酵母属、隐球菌属、红酵母属和球拟酵母属。

在52-58℃环境下，生长态细胞通常在5-10分钟内死亡。孢子（囊孢子）耐热性更强，但暴露在60-62℃下数分钟后即被灭活。

氧

酵母菌在有氧和无氧的环境中都能生长，即酵母菌是兼性厌氧菌。在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和水。在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水。酵母菌在有氧情况下生长更快。

酵母菌的分类

根据产孢子（囊孢子与担孢子）能力，酵母分为三类——产孢菌株属于子囊菌类和担子菌类；不产孢但主要靠出芽繁殖的菌株属于半知菌类。

酵母菌的重要性

从乳制品角度来看，酵母菌通常属于不良微生物，但有一个例外。开菲尔（Kefir）是一种俄罗斯发酵乳制品，采用酵母菌与乳酸菌的混合培养物（颗粒状聚合体）进行发酵。其他情况下，酵母会导致培养乳制品（包括干酪和黄油）出现严重缺陷。另一方面，在酿酒、葡萄酒、烘焙和蒸馏行业中，酵母菌发挥着重要价值。

霉菌

霉菌这一类别包含了一组具有显著异质性的多细胞丝状真菌。霉菌由称为菌丝的丝状细胞链构成，肉眼可见的菌丝团称为菌丝体。细胞间的菌丝可能有也可能没有隔膜，通常呈分枝状。菌丝是霉菌的营养部分，通常无色，且能分泌酶类来降解食物（图4.22）。

随着霉菌菌落生长，菌丝与菌丝体从中央向外扩散。

图4.22 霉菌菌丝可具隔膜或无隔膜，具体取决于所属类群

霉菌的繁殖

霉菌通过各类孢子进行繁殖，同一菌种可能兼具有性和无性繁殖方式。无性孢子通常壁较厚，相对耐干燥。部分菌株拥有高度耐热的有性孢子。霉菌能以孢子形态长期保持休眠状态。

分生孢子是最为常见的霉菌无性繁殖方式（图4.23），且通常会大量产生。它们很小很轻，能借助气流传播，从而推动霉菌的扩散。这是日常常见现象，常给乳业带来困扰。

图4.23 具有分生孢子梗的青霉菌菌丝体产生分生孢子链

霉菌的代谢

霉菌真菌的代谢方式与酵母菌高度相似。其具备丰富的酶系统，可分解多种有机物质。从乳制品角度来看，霉菌对脂肪和蛋白质的作用尤为值得关注。霉菌菌丝体的生长过程如图4.24所示。

图4.24 源于单个孢子（S）的霉菌菌丝体在麦芽琼脂上经20℃培养一日后的生长状态

水分

霉菌能在含水量很低的物质上生长，并且能从潮湿的空气中吸收水分。

水分活度（a_w）

霉菌比任何其他微生物类群更耐受低a_w。部分霉菌可耐受高渗透压的糖盐浓度（例如，果脯和甜炼乳）。

氧

霉菌通常在有氧条件下生长。氧气是分生孢子形成和菌丝体生长的必要条件。

温度

大多数霉菌的最适生长温度是20-30℃。

酸度

霉菌可在pH值3至8.5的介质中生长。然而，许多霉菌菌种偏好酸性环境（如干酪、酸奶、柑橘类水果及果汁）。

霉菌在乳业中的重要性

与酵母菌类似，除具耐热有性孢子的霉菌外，普通霉菌无法在72-74℃持续10-15秒的常规巴氏杀菌温度下存活。因此，这类微生物的非预期存在意 味着再污染。霉菌有很多不同的科，对乳品业重要的霉菌有青霉菌属和乳霉菌属（白地霉）。

青霉菌属

青霉菌属是最常见的霉菌类型之一。该科产孢菌丝的顶端呈分枝状，形似刷子。广泛存在于自然界中的绿霉即属于此科。部分青霉菌种在乳品加工中发挥重要作用：其强大的蛋白质与脂肪分解能力使其成为蓝纹干酪、卡门培尔干酪等成熟过程的主导菌种。蓝纹干酪霉菌称为罗克福尔青霉，卡门培尔干酪霉菌称为卡门培尔青霉，如图4.23所示。

乳霉菌属

乳霉白地霉介于酵母菌和霉菌之间。其繁殖方式与酵母菌类似：菌丝外部通过类似出芽的过程缢裂分离。其结构如图4.25所示。该霉菌常在发酵乳表面形成细腻的白色绒状覆盖层，参与半软质与软质干酪的成熟过程，但可能导致黄油酸败。

干酪与黄油表面的霉菌会导致变色，并产生异味。乳制品加工过程中必须严格保持卫生，以免产品受到霉菌的影响。例如，墙壁与天花板必须严格保持清洁，以免霉菌附着滋生。

图4.25 白地霉菌的结构

噬菌体

图4.26 噬菌体结构示意图

英国科学家Twort早在1915年就发现：某些葡萄球菌培养物会发生裂解现象。数年后，加拿大科学家d'Herelle在进行类似观察后，推测这种现象由以细菌为食的不可见生物造成，并将其命名为噬菌体。

因此，噬菌体实为病毒（即细菌寄生物），其可独立存活，但只能在细菌细胞内生长复制。它们具有高度特异性宿主（例如，特定菌种或菌株）。

噬菌体的结构

各种噬菌体的尺寸差异显著，需借助电子显微镜观察。最大噬菌体之一是T系噬菌体，其专感染大肠杆菌及近缘细菌。T系噬菌体具有“头部”与“尾部”结构，尺寸介于0.03-0.3μm之间。噬菌体的结构示意图如图4.26所示。

图4.27 噬菌体增殖示意图

噬菌体的繁殖

噬菌体会攻击生长活跃的细菌，并在其内部复制。细菌随后会裂解，每个细菌释放出10-200个噬菌体去攻击其他细菌。这一过程如图4.27所示。

噬菌体附着于宿主表面（1），其将DNA注入细胞。细胞“机器”随后产生新的噬菌体DNA与蛋白质（2；3）。新噬菌体在菌体内组装（4），随后细菌裂解（5）并释放成熟噬菌体。

噬菌体在乳业中的重要性

由于原奶通常会受噬菌体污染，因此发酵剂所用的乳（一般为脱脂乳）必须加热至90℃并保持30分钟以灭活噬菌体。图4.28展示了未执行该处理或后续再次受到噬菌体污染的情况。一个“未感染”细菌产生四个新细菌所需的时间为两代。在同一时期，一个噬菌体感染一个细菌后，单代即可释放150个新噬菌体。这些噬菌体感染150个新细菌，再经一代后释放22500个噬菌体。

图4.28 发酵剂菌种与噬菌体的生长及对受感染发酵剂的影响

总结

种类繁多的细菌、酵母菌和霉菌及其广泛的活动，对地球生命（尤其是人类）具有至关重要的意义。

土壤和水中的微生物负责将现有养分降解为植物可吸收的形式，这一过程同时为动物界（包括人类）提供了间接服务。

人类也能更直接地从微生物中获益。例如，产乳酸微生物可用于保存牲畜饲料（青贮饲料）。相同原理适用于酸菜、青橄榄和黄瓜等食品的制备。

微生物在酸奶、干酪和发酵黄油等乳制品生产中至关重要。选择正确的微生物类型是最大限度地提高这些产品质量的一个重要因素。

乳制品生产用微生物通常由专业公司提供，这些公司在严格控制的卫生条件下开展微生物的研发与增殖培养工作。乳品行业使用的微生物被称为发酵剂。有一种发酵剂是通过发酵乳糖产乳酸的微生物混合物。然而，必须确保发酵剂抵达乳品厂后仍通过高标准卫生条件保持其质量，并且在使用时，在加工链关键环节应用无菌技术。

在此需特别说明，牛奶中可能含有治疗奶牛乳房炎残留的抗生素（最常见的是青霉素）。尽管法规禁止将经抗生素治疗的奶牛所产牛奶送往乳品厂，但在散装罐装牛奶中，仍可能检测到浓度足以抑制或延缓发酵剂生长的抗生素。图4.29展示了微量青霉素残留对最常用发酵剂
的影响。

图4.29 牛奶中青霉素对产酸的影响

将微生物过度理想化而忽略了某些微生物（即致病微生物）被视为人类最危险敌人，是一种错误的观念。由于抗生素的滥用，其对人类的威胁日益严重——部分致病菌现已对所有抗生素产生耐药性。确实，若没有众多无害微生物，人类及其他生物将无法生存。

多数国家政府已立法要求乳品厂生产的食用牛奶必须经过巴氏杀菌。典型的巴氏杀菌温度/时间组合为72℃维持15-20秒，这样可杀灭所有致病菌。为避免再污染，严格执行良好卫生规范至关重要。